细胞凋亡是一种正常的生理过程，发生在胚胎发育过程中以及组织稳态的维持过程中。细胞凋亡程序的特征在于某些形态学特征，包括质膜不对称性和附着的丧失、细胞质和细胞核的浓缩以及 DNA 的核小体间裂解。质膜缺失是最早的特征之一。在凋亡细胞中，膜磷脂磷脂酰丝氨酸 (PS) 从质膜的内部转移到外部小叶，从而将 PS 暴露于外部细胞环境。Annexin V 是一种 35-36 kDa Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，对 PS 具有高亲和力，并与暴露的 PS 细胞结合。Annexin V 可以与包括 FITC 在内的荧光染料结合。这种形式保留了其对 PS 的高亲和力，因此可作为对正在发生凋亡的细胞进行流式细胞术分析的灵敏探针。由于 PS 的外化发生在细胞凋亡的早期阶段，因此 FITC Annexin V 染色可以比基于核变化（如 DNA 片段化）的检测更早地识别细胞凋亡。
FITC Annexin V 染色发生在膜完整性丧失之前，伴随着细胞凋亡或坏死过程导致的细胞死亡的新阶段。因此，FITC Annexin V 染色通常与活性染料（如碘化丙啶 (PI) 或 7-氨基放线菌素 (7-AAD)）结合使用，使研究人员能够识别早期凋亡细胞（PI 阴性，FITC Annexin V积极的）。具有完整膜的活细胞排除 PI，而死亡和受损细胞的膜可渗透 PI。例如，被认为有活力的细胞是 FITC Annexin V 和 PI 阴性；早期凋亡细胞FITC Annexin V阳性，PI阴性；凋亡晚期或已经死亡的细胞FITC Annexin V和PI均为阳性。该测定不区分经历凋亡死亡的细胞与因坏死途径死亡的细胞，因为在任何一种情况下，死细胞都会被 FITC 膜联蛋白 V 和 PI 染色。然而，当随着时间的推移测量细胞凋亡时，通常可以追踪细胞从 FITC Annexin V 和 PI 阴性（有活力或不可测量的细胞凋亡），到 FITC Annexin V 阳性和 PI 阴性（早期细胞凋亡，存在膜完整性），最后到FITC Annexin V 和 PI 阳性（终末期细胞凋亡和死亡）。细胞通过这叁个阶段的运动表明细胞凋亡。相比之下，表明细胞同时为 FITC Annexin V 和 PI 阳性的单一观察结果本身揭示的对于细胞死亡过程的信息较少。死细胞会被 FITC Annexin V 和 PI 染色。然而，当随着时间的推移测量细胞凋亡时，通常可以追踪细胞从 FITC Annexin V 和 PI 阴性（有活力或不可测量的细胞凋亡），到 FITC Annexin V 阳性和 PI 阴性（早期细胞凋亡，存在膜完整性），最后到FITC Annexin V 和 PI 阳性（终末期细胞凋亡和死亡）。细胞通过这叁个阶段的运动表明细胞凋亡。相比之下，表明细胞同时为 FITC Annexin V 和 PI 阳性的单一观察结果本身揭示的对于细胞死亡过程的信息较少。死细胞会被 FITC Annexin V 和 PI 染色。然而，当随着时间的推移测量细胞凋亡时，通常可以追踪细胞从 FITC Annexin V 和 PI 阴性（有活力或不可测量的细胞凋亡），到 FITC Annexin V 阳性和 PI 阴性（早期细胞凋亡，存在膜完整性），最后到FITC Annexin V 和 PI 阳性（终末期细胞凋亡和死亡）。细胞通过这叁个阶段的运动表明细胞凋亡。相比之下，表明细胞同时为 FITC Annexin V 和 PI 阳性的单一观察结果本身揭示的对于细胞死亡过程的信息较少。存在膜完整性），最后变为 FITC Annexin V 和 PI 阳性（终末期细胞凋亡和死亡）。细胞通过这叁个阶段的运动表明细胞凋亡。相比之下，表明细胞同时为 FITC Annexin V 和 PI 阳性的单一观察结果本身揭示的对于细胞死亡过程的信息较少。存在膜完整性），最后变为 FITC Annexin V 和 PI 阳性（终末期细胞凋亡和死亡）。细胞通过这叁个阶段的运动表明细胞凋亡。相比之下，表明细胞同时为 FITC Annexin V 和 PI 阳性的单一观察结果本身揭示的对于细胞死亡过程的信息较少。
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FITC Annexin V 是一种用于识别凋亡细胞的灵敏探针，与带负电荷的磷脂表面结合（Kd 约为 5 x 10^-2），对磷脂酰丝氨酸 (PS) 的亲和力高于大多数其他磷脂。FITC Annexin V 结合是钙依赖性的，如 FITC Annexin V 染色方案中所述，最佳染色需要确定的钙和盐浓度。 研究人员应注意，FITC Annexin V 对贴壁细胞类型（例如 HeLa、NIH 3T3 等）的流式细胞术分析并非常规测试，因为在细胞分离或收获过程中可能会发生特定的膜损伤。然而，之前已经报道了利用膜联蛋白 V 对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法（Casiola-Rosen 等人和 van Engelend 等人）。
喜树碱诱导细胞凋亡
提供以下协议作为说明如何在细胞系 (Jurkat) 上使用 FITC 膜联蛋白 V。
材料
1. 制备喜树碱储备液（Sigma-Aldrich 目录号 C-9911）：1 mM DMSO 溶液。
2. Jurkat T 细胞 (ATCC TIB-152)。
程序
1. 将喜树碱（最终浓度 4-6 µM）添加到 1 x 10^6 Jurkat 细胞中。
2. 在 37°C 下孵育细胞 4-6 小时。
3. 继续使用 FITC Annexin V 染色方案来测量细胞凋亡。
FITC 附联蛋白 V 染色方案
FITC Annexin V 用于定量确定细胞群中正在积极经历凋亡的细胞百分比。它依赖于细胞在细胞凋亡的早期阶段失去膜不对称性的特性。在凋亡细胞中，膜磷脂磷脂酰丝氨酸 (PS) 从质膜的内叶转移到外叶，从而将 PS 暴露于外部环境。Annexin V 是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，对 PS 具有高亲和力，可用于鉴定暴露于 PS 的凋亡细胞。碘化丙啶 (PI) 是一种标准的流式细胞仪活性探针，用于区分活细胞和非活细胞。具有完整膜的活细胞排除 PI，而死细胞和受损细胞的膜可渗透 PI。FITC Annexin V 染色呈阳性而 PI 呈阴性的细胞正在发生凋亡。FITC Annexin V 和 PI 染色呈阳性的细胞要么处于细胞凋亡的末期，要么正在发生坏死，要么已经死亡。FITC Annexin V 和 PI 染色均为阴性的细胞是活的，没有发生可测量的细胞凋亡。
试剂
1. FITC Annexin V（成分编号 51-65874X）：每次测试使用 5 µl。
2. 碘化丙啶 (PI)（组分编号 51-66211E）是一种方便的即用型核酸染料。每次测试使用 5 µl。
3. 10X 膜联蛋白 V 结合缓冲液（组分号 51-66121E）：0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4)、1.4 M NaCl、25 mM CaCl2。对于 1X 工作溶液，将 1 份 10X 膜联蛋白 V 结合缓冲液稀释至 9 份蒸馏水。
染色
1. 用冷 PBS 洗涤细胞两次，然后以 1 x 10^6 个细胞/ml 的浓度在 1X 结合缓冲液中重悬细胞。
2. 将 100 µl 溶液（1 x 10^5 个细胞）转移到 5 ml 培养管中。
3. 加入 5 µl FITC Annexin V 和 5 µl PI。
4. 轻轻涡旋细胞并在室温 (25°C) 黑暗中孵育 15 分钟。
5. 向每管中加入 400 µl 1X 结合缓冲液。在 1 小时内通过流式细胞仪进行分析。
设置流式细胞术的建议控制
以下控件用于设置薪酬和象限：
1. 未染色的细胞。
2. 用 FITC Annexin V（无 PI）染色的细胞。
3. 用 PI 染色的细胞（无 FITC Annexin V）。
其他染色对照：
应使用易于诱导细胞凋亡的细胞系来获得 FITC 膜联蛋白 V 和/或 FITC 膜联蛋白 V 和 PI 的阳性对照染色。重要的是要注意细胞凋亡和坏死的基础水平在人群中有很大差异。因此，即使在没有诱导细胞凋亡的情况下，大多数细胞群也会包含一小部分细胞凋亡阳性（FITC Annexin V 阳性，PI 阴性或 FITC Annexin V 阳性，PI 阳性）。
未处理的群体用于定义凋亡和死细胞的基础水平。然后通过从处理过的细胞群中凋亡细胞的百分比中减去未处理过的细胞群中凋亡细胞的百分比来确定已经被诱导经历细胞凋亡的细胞的百分比。由于细胞死亡是细胞经历凋亡的最终结果，处于凋亡后期的细胞将有受损的细胞膜，并且 PI 和 FITC 膜联蛋白 V 染色呈阳性。因此，该测定无法区分已经经历过凋亡的细胞凋亡细胞死亡和那些因坏死途径而死亡的细胞，因为在任何一种情况下，死细胞都会被 FITC Annexin V 和 PI 染色。
准备和存储
在 4°C 下未经稀释储存，并避免长时间暴露在光线下。不要冻结。
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